Inoculation d’une boite de pétri

Suite à mon article sur la congélation d’une souche de levure, je souhaite maintenant aborder la suite, à savoir l’inoculation d’une boite de pétri. Cette technique possède l’avantage d’utiliser un tube de levures de multiples fois. Il est tout aussi possible de ce servir de cette technique d’un milieu liquide vers le pétri, dans le but par exemple d’isoler une souche des autres.

Tout comme l’article sur la banque de levure je tiens à rappeler quelque chose.

Avant de vous présenter MA méthode je tiens à préciser les choses. J’insiste sur le fait que tout ceci est MA méthode, dans le sens où elle n’est certainement pas parfaite du simple fait que je ne suis pas biologiste de formation. Tout ce que je sais je le dois en premier lieu à Nezahualcoyotl du forum brassageamateur.com qui lui est un vrai pro du domaine ! Au passage, il fournis des tubes de levures (il possède toutes les souches commerciale) à un tarif très intéressant et surtout d’une fraicheur (vitalité) inégalée. N’hésitez pas à le contacter !

Ma deuxième source de connaissance n’est autre que le livre Yeast: The Practical Guide to Beer Fermentation un must have pour tout ceux et celles intéressés par les saccharomyces cerevisiae, brettanomyces, Pediococcus , Lactobacillus , etc….

Enfin mon meilleur ami m’a donné quelques conseils, étant lui ingénieur en biologie industrielle. Ainsi, je vous présente ma façon de faire, qui marche de mon côté et qui je le crains, n’est pas parfaite. Si jamais vous voyez des pistes d’amélioration je suis preneur !

nous pouvons donc maintenant avancer sur le sujet. Sachez qu’il est plutôt délicat d’effectuer cette manipulation, particulièrement pour les non initiés comme moi. Vous dire que le risque d’infection est omniprésent est un euphémisme.. Néanmoins, rien n’est impossible si vous êtes attentif à votre travail.

Avantages

  • Réutiliser un tube de levures de très nombreuses fois
  • Isoler une souche parmi d’autres micro organismes
  • Possibilité de conserver ses souches de levures sur pétri. (facilement 6 mois au frigo)

Inconvénients

  • Infections très probables au moindre faux pas
  • Processus à prévoir en avance, 10j avant le brassage minimum
  • Matériel spécifique à prévoir
  • Activité très chronophage

Les inconvénients sont nombreux, surtout lorsque vous ne travaillez pas dans un laboratoire. Il ne faut pas perdre de vue qu’il est important de devoir tout préparer à l’avance. Vos pétris, vos starters de 20ml, stériliser, nettoyer la surface de travail, ect.. Si je peux vous donner un conseil, il est judicieux de préparer à l’avance quelques boîtes de pétri et des tubes de 20ml de moût à l’avance. De ce fait, vous pouvez vous concentrer sur l’inoculation un autre jour.

Le matériel nécessaire 

Du matériel très spécifique est nécessaire pour inoculer votre boîte de pétri.

  • Un bec Bunsen
  • Un œil d’inoculation
  • Une cocotte minute (Autoclave)
  • Des boîtes de pétri en verre ou en plastique déjà préparé
  • Des tubes avec bouchon refermable de 50ml

Préparation des boites de pétri

Dans un premier temps, je vais vous expliquer comment préparer vos boites de pétri. Il est aussi possible de demander à Nezahualcoyolt de vous en vendre quelques boites. J’utilise personnellement des boites de pétri en verre, que je réutilise. Pour la taille, plus la boite est large, plus vous pouvez cultivez différentes souches sur une seule boite pour expérimenter. Pour préparer le médium, j’utilise un erlenmeyer de 250ml.

Préparation pour 100ml (soit 3 ou 4 boites de 10cm de diamètre)

 

  • 100ml d’eau
  • 2 à 4g de malt en poudre
  • 2g agar agar
  • En option : des nutriments pour levures

Un bon conseil, ne versez par l’agar agar d’un coup, vous allez vous retrouver avec un amat colmaté. Faite tourner le liquide dans l’erlenmeyer et ajoutez progressivement l’agar agar pour l’incorporer. Je fais ensuite bouillir le tout pendant 6 à 10 minutes et je laisse le médium liquide refroidir un peu pendant 10 minutes. C’est une étape importante car si vous versez le liquide trop chaud sur du plastique il peut fondre, ou bien craquer le verre. Voici le résultat qu’il faut obtenir globalement (une pâte de 2mm).

Bon là ce n’est pas hyper droit mais ce n’est pas gênant la surface reste plate !

Même si vous aviez stérilisé vos boites, je vous conseil un passage à l’autoclave (cocotte minute) pendant 20 minutes à pleine pression (d’où l’intérêt du verre). Cela va liquéfier le médium, soyez prudent en ressortant votre boite, le médium durcira ensuite en refroidissant.

Voilà, vous avez préparer vos boites de pétri. Mais pour gagner du temps et ne faire un passage à autoclave qu’une seule fois, je vous conseille de préparer le premier milieu liquide qui accueillera vos colonies de levures cultivez sur pétri.

J’utilise des tubes de 50ml pour une préparation de 20ml de milieu liquide à 1.020. Pour ne pas brutaliser nos céllules, il est important de commencer avec une Di faible, 1.020 étant bien adapté. Ici rien de particulier à dire, c’est probablement le plus petit starter que vous allez utiliser… Je prépare souvent 4 ou 5 tubes d’un coup.

  • 100ml d’eau
  • 5g de malt en poudre
  • option : nutriments

Vous répartissez ensuite 20ml dans chaque tubes avant des les passer à l’autoclave. Il est important de ne pas fermer le capuchon mais de le laisser sur le tube. Je le recouvre d’aluminium. Le but c’est de laissé la vapeur pénétrer dans le tube, tout en évitant de contaminer l’intérieur du tube lors de la fermeture du tube. Un peu comme sur le schéma ici :

Schéma d’un tube dans l’auto clave. L’aluminium doit laissé passer la vapeur !

Vous avez maintenant vos boites de pétri ainsi que vos mini starter, nous pouvons passer à la suite !

L’inoculation

Nous voila à l’opération qui est selon moi la plus délicate. La moindre erreur sera très largement visible sur votre boite de pétri, moisissure et compagnie.. La première chose à faire c’est de préparer votre plan de travail. Je passe un peu d’alcool à 70° sur le plan de travail. Idem je passe un coton d’alcool sur mes boites de pétri et sur mes différents tubes. Je réparti ensuite mes différents équipement avec le Bec Bunsen idéalement placé pour protéger ma zone de travail, sans me bruler.

Plan de travail

Je n’amène mes tubes congelés qu’au dernier moment pour éviter de trop les décongeler. Une fois que tout est là, voici les étapes à respecter

  1. Allumer le Bec Bunsen
  2. Passer le l’œil d’inoculation à la flamme, attendre qu’il soit blanc et parcourir “rapidement” le reste de la tige
  3. Reposer l’œil très proche de la flamme
  4. Passer le tube congelé à la flamme rapidement
  5. Poser le bouchon à plat proche de la flamme
  6. Ouvrir le tube et passer les bords rapidement à la flamme
  7. Repasser l’œil à la flamme et le refroidir sur le pétri vierge en entrouvrant la boite
  8. Tremper l’œil dans le tube et gratter un peu
  9. Griffer légèrement le contenu gelé avec l’œil
  10. Appliquer en suivant le schéma ci-dessous

Je n’ouvre jamais en grand la boite de pétri, je me contente simplement d’entrouvrir le temps de passer l’oeil sur le pétri. Le but est bien évidemment de limiter un maximum l’exposition aux nuisibles dans l’air. Une fois cette opération réalisée, il faut bien évidemment refermer les tubes tout en les passants rapidement à la flamme au niveau du bouchon et de la fermeture. Ensuite, remettez les sans atteindre au frais.

Du côté des boites de pétri, vous devez les conserver à température ambiante et idéalement autour 30°c voire 35°c qui est la température idéale de reproduction de nos levures. Les premières colonies devraient devenir visible à l’oeil nu sous plus ou moins 3 jours.

Évidemment ouvrir une boite et prendre des photos la condamne à l’infection. Photo post utilisation donc !

 

Une boite de pétri inoculé c’est bien, surtout s’il n’y a pas d’autres invités avec nos levures. Une fois les colonies développées, vous pouvez les mettre au frigo (et pas au congélateur !) et les conserver pendant facilement 6 mois voire le double ou le triple. Mais concrètement, un point blanc ne représente qu’une colonie de quelques millions de cellules. On est loin, très loin des 100 milliards d’un pack de Wyeast. Alors comment fait-on ? C’est simple, on passe du pétri au milieu liquide, mais pas n’importe comment ! Pour ma part je passe par 3 phases pour ensuite inoculer 13L de mout. Très franchement, je ne me suis pas encore attardé sur le nombre de cellules que j’avais. C’est une chose que je vais améliorer dans un prochain temps, mais mes résultats me satisfont pour le moment?

C’est parti pour une pyramide de starter, avec le premier et plus petit starter que j’utilise… de 20ml ! Pas question de mettre nos levures sous un stress trop fort et risquer de limiter leur reproduction ou de dégrader leur santé (recette de ce starter en haut de l’article). Pour ce faire, on reprend l’installation du début, surface clean, erlenmeyer et oeil d’inoculation passé à la flamme. Ensuite je viens gratter quelques colonies sur le pétri et j’inocule mon tube de 20ml. Toutes les précautions d’hygiène vue plus haut sont toujours de rigueur !

  1. Starter 20ml
  2. Starter 250ml 1.040
  3. Starter 1L 1.040

Lorsque j’arrive à la fin de mon starter de 1 litre, je laisse mes levures se reposer et je les laisse au frigo pendant au moins 48h dans le seul but de pouvoir décanter le plus de liquide possible et de garder le “gâteau” de levures fraiches au fond de l’erlenmeyer. Évidemment, avant de les envoyer dans le fermenteur je les laisse revenir à température ambiante. Il serait préférable d’utiliser les levures dans leur phase la plus active au lieu de les passer au frais, mais l’idée d’ajouter 1L de starter dans mes 13L de mout me déplait fortement d’un point de vue gustatif.

Conclusion

J’espère avoir pu vous permettre de comprendre comment inoculer une boite de pétri. Je vais essayer de faire une vidéo prochainement pour vous rendre la chose encore plus claire. Si vous deviez retenir une seule chose de cet article, c’est que si vous ne pouvez pas respecter les contraintes de temps et sanitaire alors l’utilisation de cette méthode n’est pas pour vous. Malgré tout, l’erreur arrive et je vous prépare une prochain article sur comment utiliser une boite de pétri infectée ! N’hésitez pas à m’apporter votre avis et vos conseils.

Charles

One thought on “Inoculation d’une boite de pétri

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